关键词: 动物模型 自发性高血压大鼠线栓法局灶性脑缺血/ 再灌注
摘 要:
目的 探讨自发性高血压大鼠局灶性脑缺血/ 再灌注模型制备方法及其可行性。
方法 采用线栓法对84只雄性自发性高血压大鼠进行局灶性脑缺血/ 再灌注模型制作，并以30只SD大鼠作为对照。术后24小时应用神经行为学评分、氯化三苯基四氮咪( TTC)染色法评价大鼠局灶性脑缺血/ 再灌注模型制备的成功率及可靠性。
结果 自发性高血压大鼠组模型制作成功60只（71%），术中、术后死亡20只(23.8%)，未成功4只(4.7%)；而SD大鼠模型制作成功26只（86.7%），术中、术后死亡3只（10%），未成功1只（3.3%）。自发性高血压大鼠组模型制作成功率低于SD大鼠，但两者比较无统计学显著性意义(x2值为3.69，P>0.05)。自发性高血压组脑梗死面积和神经行为损伤均比SD大鼠组显著(P<0.05)。
结论 采用线栓法制作自发性高血压大鼠局灶性脑缺血/ 再灌注模型方法可行，稳定性较好。
采用血管内直接线栓闭塞法(线栓法)阻断SD (Sprague Dawley) 大鼠或Wistar大鼠大脑中动脉(MCA) 建立局灶性脑缺血再灌注模型方法比较成熟，是研究缺血性脑血管病的常用方法，在科研中得以应用广泛[1，2]。但是SD大鼠或Wistar大鼠缺乏导致脑缺血及缺血再灌注的脑动脉粥样硬化等血管壁病变的病理基础，建立的局灶性脑缺血再灌注模型尚不理想[2]。如采用自发性高血压大鼠建立局灶性脑缺血再灌注模型，可能更接近接近人类脑血栓形成发病或脑缺血及缺血再灌注过程，其实验结果更有指导意义。选择自发性高血压大鼠为造模动物，用线栓法制备局灶性脑缺血再灌注模型目前国内外报道甚少。本研究对采用线栓法对84只雄性自发性高血压大鼠进行局灶性脑缺血/ 再灌注模型制作，并以30只SD大鼠作为对照，报道如下。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
成年雄性自发性高血压大鼠84只，月龄2～3 月，平均体重250±30g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，每只大鼠术前连续三天测尾动脉压1次/日，收缩压平均值均在160mmHg以上。SD雄性大鼠30只，月龄2～3 月， 平均体重240±24g，由中南大学湘雅医学院实验动物学部提供。每只大鼠术前连续三天测尾动脉压1次/日，连续三天，收缩压平均值均在140mmHg)以下。
1.1.2 实验材料
血管内栓塞线取美国产4.0单股蓝色心血管外科尼龙丝线长度4 cm，头端加热烧灼成光滑球形，球体直径约为0.2 mm，70%乙醇消毒后置生理盐水中备用。脑梗死灶染色用氯化三苯基四氮唑( TTC) ，由上海化学试剂厂生产，用0.2mol/L 磷酸缓冲液(PBS) 配制成2%TTC 溶液(pH7.5)，避光保存。
1.2 手术方法
手术前两组大鼠自由饮水和进食。按外科无菌手术进行操作，10%水合氯醛(0.3m l/100g)腹腔内注射麻醉，麻醉后大鼠仰卧固定于手术台上， 颈部正中切口，逐层分离， 在手术显微镜下分离右侧颈总动脉(CCA)、右侧颈外动脉(ECA) 和右颈内动脉(ICA)。电凝ECA的分枝， 结扎游离ECA 主干。分离ICA主干至翼腭动脉(PPA)。ECA残端剪0.2mm小口， 并在ECA的小口远端用手术丝线置一活动线结。将栓塞线自ECA小口插入，轻推栓塞线尾端经CCA 分叉部沿ICA将钓丝缓慢地向颈内动脉入颅内的方向推进约19～21 mm，微遇阻力时停止，使栓塞线头端通过MCA起始处，即完成对一侧MCA的阻塞(MCAO)，记录此时的时间。2 h 后再灌注时，缓慢地轻拉出栓塞线，将ECA 残端栓塞线插入口远端活动线结结扎，使CCA血流与ICA再通，实现对大脑中动脉再灌注。以上两组动物在手术中均用白炽灯加热，以保持体温恒定(肛温37 ℃左右)。
1.3 神经功能缺失评分
术后24h后参照Bederson方法对两组大鼠行神经行为学评分。其中无神经功能缺损症状为0分；1分指轻微的神经功能缺损；2分指中度局灶性神经功能缺损，有向瘫痪侧旋转征象；3分指重度局灶性神经功能缺损，有向病灶对侧跌倒的征象，或直走困难，出现打圈现象；4分指无自发活动及意识水平下降。
1.4 脑组织梗死面积检测
神经行为学评分后两组大鼠10%水合氯醛腹腔深度麻醉(0.3m l/100g)，迅速开胸、开腹暴露心脏、腹主动脉，左心室穿刺插管作为灌注液流入口，剪开右心耳作为灌注液流出口，夹闭胸腹主动脉，5min内经左心室快速灌注37℃生理盐水l00ml冲洗。迅速断头取脑，取大鼠视交叉后的脑组织，剥离血管和脑膜，冰冻脑组织30min，冠状位由前向后切片，间隔2mm连续做5等份切片，切片包括侧脑室室管膜下以及海马区，放入含4%TTC染液中，37℃避光染色20 min。正常脑组织染成红色，梗死组织不着色(呈白色)，滤除TTC染液，置于10%甲醛溶液中固定保存。过夜后将脑组织标本平铺好，奥林巴斯相机摄相，应用德国KONTRON—IBAS2.5全自动图像分析系统计算鼠脑梗死灶面积占大脑面积的百分比。
1.5 造模成功标准
神经行为学评分评分1分以上，并且TTC染色可见明显缺血灶为造模成功标准，计算造模成功率。
1.6 统计学处理:
采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。百分率的比较采用χ2检验，Bederson评分以等级资料表示，采用秩和检验；取0.05作为检验水准，P﹤0.05为统计学差别显著性意义。
2 结果
2.1 模型制备成功率比较
自发性高血压大鼠局灶性脑缺血/ 再灌注模型制备成功60只（71%），术中、术后死亡20只(23.8%)，未成功4只(4.7%)；而SD大鼠局灶性脑缺血/ 再灌注模型制作成功26只（86.7%），术中、术后死亡3只（10%），未成功1只（3.3%）。自发性高血压大鼠模型制备成功率低于SD大鼠，但两者比较无统计学显著性意义(x2值为3.69，P>0.05)。
2.2 神经行为学评分比较
模型制备成功的自发性高血压大鼠组Bederson评分大多数为2～3分，而模型制备成功的SD大鼠组得分比较分散（见表1）。经秩和检验，两组差异具有显著性意义(P <0.05)。提示自发性高血压大鼠制备的局灶脑缺血模型神经行为损伤比SD大鼠程度较重，并且损伤程度相近，稳定性较好。
表1：两组大鼠模型神经行为学评分比较
|
Bederson评分(分) 自发性高血压大鼠组 SD大鼠组a
(n=60) (n=26) |
|
0 0 0
1 2 6
2 24 12
3 32 7
4 2 1 |
a: P < 0.05 vs SD大鼠组
2.3 脑梗死面积比较
TTC染色显示两组大鼠模型右侧大脑半球缺血区呈苍白色，非缺血区呈红色，梗塞范围主要累及右侧大脑中动脉供血区的纹状体、皮质下白质和部分皮质。模型制备成功的自发性高血压大鼠组脑梗死面积为42.6±5.6 %，比SD大鼠组29.5±6.7 %有显著性增加(x2值为5.77，P<0.05)。.
3 讨论
制备脑缺血模型的理想动物不仅应满足造模后模型成功指标明确、病灶稳定、重复性强的基本条件，而且应当尽可能再现人类脑梗塞病理基础与发病过程。所以，脑缺血动物模型要求具备[1，2]：
①造模的动物脑血管解剖结构、生理特点等与人类接近；
②造模的动物有脑血管病基础病变，脑梗塞后的病理生理过程等接近人类；
③尽量保持颅脑的完整性，避免干扰脑脊液动力学和脑血管的自动调节功能。
研究[3，4]显示自发性高血压大鼠脑血管解剖结构与人类相近，有完整的脑底动脉环。而且自发性高血压大鼠具有与人类高血压病相似的脑血管病理变化基础，脑梗塞后的病理生理过程接近人类。有研究证实[4，5]高血压大鼠在高血压初期大脑中动脉内弹力膜略增厚， 中膜平滑肌细胞略有肥大；成年鼠大脑中动脉中膜平滑肌细胞层数稍增多， 排列较紊乱， 胞体增大， 细胞间隙增宽；自后微血管闭塞、退化，侧支吻合血管减少，大脑中动脉细胞外间质增多，平滑肌细胞排列紊乱，并出现片状坏死的平滑肌细胞。所以，本研究选择自发性高血压大鼠为造模动物对临床指导意义和价值高于选择血压正常的SD或Wister大鼠。
线栓法制作的局灶性脑缺血模型具有不开颅，保持颅脑的完整性，避免干扰脑脊液动力学的优点，而且梗塞部位较确定、效果肯定，可准确控制缺血及再灌注时间等优势，在国内外得到了广泛的采用[1，2，6]。本研究用自发性高血压大鼠为造模动物，采用线栓法制备局灶性脑缺血/ 再灌注模型，结果证实造模成功率较高，梗塞部位主要集中于大脑中动脉供血区的纹状体、皮质下白质和部分皮质，并且神经功能损伤肯定、较为集中。结果还显示与SD大鼠比较，自发性高血压大鼠脑梗塞面积较大，神经功能损伤较重；造模成功率较低，术中术后死亡率较高；其原因可能与后者有高血压和存在高血压性脑血管病变的病理基础相关。
自发性高血压大鼠价格较高，降低自发性高血压大鼠制备局灶性脑缺血/ 再灌注模型术中术后死亡率是值得探讨的问题。本研究经验是实验前研究者采用价格低廉的SD大鼠熟悉造模手术方法，术中术后注意对实验动物保温，术后加强对实验动物观察与照顾，对危重实验动物可将供水瓶低置、食物粉碎后置于动物周边等。
总之，本研究结果证实采用线栓法制作自发性高血压大鼠局灶性脑缺血/ 再灌注模型方法可行，稳定性较好。
参考文献：
1. 郑冲，吴钢. 局灶性脑缺血动物模型制作方法的概述［J］. 中国卒中杂志， 2008，3(8): 603-607.
2. 王伟 严格控制实验条件，建立标准化脑缺血动物模型［J］. 中华神经科杂志，1998，31 (5):261-263.
3. 乔松，冯加纯，杨晶，等. 高血压大鼠脑内小血管改变及其继发损伤的研究［J］. 中风与神经疾病杂志，2006，23(3):290-293.
4. 郭国庆，沈伟哉. 自发性脑卒中高血压大鼠大脑中动脉超微结构的病理改变［J］.解剖学杂志，2000，23(3):242-244.
5. 汪俊元，王安才，吴明等. 血管内皮生长因子与自发性高血压大鼠血管重构的关系［J］. 心脑血管病防治， 2008；8（1）：21-23.
6. 龚彪，李长清，黄剑. SD 大鼠线栓法局灶性脑缺血/ 再灌注模型的改进［J］. 重庆医学，2006，35(4):313-315.
